Panzer III tham gia tất cả các chiến dịch từ châu Âu đến Bắc Phi. Một bộ phận các sư đoàn tinh nhuệ Panzer III có tham gia trận Normandy vào năm 1944.

Trong chiến dịch Ba Lan và Pháp, chỉ có vài trăm chiếc Panzer III được huy động tham gia chiến đấu. Các phiên bản Ausf. A-F với lớp giáp gần 50 mm và được trang bị pháo chính 37 mm cũng đủ để đánh bại các loại xe tăng hạng trung của Anh, Ba Lan và Pháp như Polish 7TP, French R-35 và H-35 một cách khá dễ dàng trong các trận đấu trực diện. Panzer III được đánh giá là loại tăng hạng trung tốt nhất thời bấy giờ.

Trong cuộc hành quân Barbarossa, Panzer III là loại tăng hạng trung chính với số lượng được huy động với hàng ngàn chiếc. Cũng trong thời điểm này, các phiên bản mới như Ausf. E-F-G và H (được trang bị pháo chính 50 mm KwK L/42) đều được xuất xưởng và đưa thẳng ra chiến trường. Tuy nhiên, số Panzer III đã vấp phải khó khăn khi đối đầu với các loại xe mới của Liên Xô là T-34 và KV-1, ngay lập tức các mẫu Panzer IV nâng cấp đầu tiên được gấp rút sản xuất để có thể cân bằng lại mặt trận. Nhưng số lượng T-34 và KVs khi đó chưa nhiều, chiếm đa số lực lượng xe tăng Liên Xô khi đó là xe tăng hạng nhẹ như T-26 và BT, chúng có hỏa lực và vỏ giáp đều kém hơn nhiều Panzer III. Số Panzer III với kíp lái được rèn luyện kĩ, vũ khí và lớp giáp bọc tốt đã đánh bại và tiêu diệt các xe tăng hạng nhẹ Liên Xô một cách dễ dàng, đánh một tỉ lệ 6:1-nghiêng về phe Đức.

Cuối chiến dịch Barbarossa, hai dòng tăng T-34 và KV được Liên Xô nhân rộng sản xuất. Ngay lập tức, Panzer III được cải tiến lại với pháo chính 50 mm L/42. Nhưng phiên bản cải tiến này vẫn không thể bắn xuyên giáp trước của T-34 và KV. Vào mùa xuân 1942, dự án thay thế pháo chính hiện tại bằng pháo 50 mm KwK-39 L/60 lắp trên Panzer III Ausf. J(1) được hoàn thành. Điều bất ngờ đã xảy ra khi phiên bản J(1) có thể xuyên được giáp trước của T-34 từ khoảng cách 500 m và tốn nhiều lần bắn để có thể xuyên thủng được giáp của KV.

Vào năm 1943, phiên bản Ausf. L được lắp thêm phần giáp váy (schürzen) để chống lại lựu đạn và các loại pháo tự hành chống tăng. Trong trận vòng cung Kursk, Panzer III có nhiệm vụ chính là hỗ trợ bộ binh, nhường lại vai trò đấu tăng cho Panzer IV và Panther (xe tăng con báo).

Panzer III được thiết kế để trở thành tăng có kíp lái ba người (pháo thủ, người thay đạn và chỉ huy). Vì thế chỉ huy tăng có thể tập trung vào việc điều khiển và quan sát bên ngoài lẫn bên trong. Đa số các loại tăng vào năm 1930 đều có cách thiết kế này. Kiểu kíp lái này có ưu điểm là: kíp lái có thể linh động theo tình huống, chỉ huy có thể tập trung vào việc quan sát, nhưng có nhược điểm là: không có người điều khiển điện đàm giúp cho việc chuyển tải thông tin không được thông suốt, số pháo thủ quá ít khiến cho việc thay đạn và khai hoả chậm gây nguy hiểm cho xe tăng.